b. Dari monohaplod dapat dihasilkan derivat yang dihaploid (diploid) dengan cara  :

• Merangkapkan kromosom dengan perlakuan colchisin
• Mengadakan silangan tanaman monohaploid

d. Dikombinasikan dengan penggunaan mutagen kimiawi atau mutagen fisik dapat menghasilkan mutan-mutan dan menghasilkan tanaman sebagai berikut :

• Tanaman yang mempunyai ketahanan terhadap penyakit, tahan rebah, dan lain-lain
• Tanaman yang lebih unggul dan hasilnya lebih tinggi
• Tanaman lebih cepat berbuah
• Toleran terhadap kadar garam ditanah yang berkadar garam tinggi, toleran terhadap kekeringan, dan toleran terhadap tekanan lainnya
• Meningkatkan kualitas nutrisi
• Menghilangkan metabolit-metabolit yang merupakan racun bagi binatang dan manusia.

 

     Untuk sterilisasinya dapat dilaksanakan dengan cara kimiawi ataupun cara fisik pemanasan. Cara kimiawi menggunakan clorox. Kepala sari atau antera yang masih terdapat didalam kuncup bunga dimasukkan kedalam erlenmeyer yang telah diisi 10% clorox dan satu tetes tween -20. Setelah itu kuncup bunga digojog selama 10 menit didalam larutan, selanjutnya kuncup dibuka dengan memakai pisau steril, antera dipotong dan dimasukkan kedalam 5% clorox + satu tetes tween-20 serta digojog selama lima menit. Sebelum ditanam diatas medium, eksplan dicuci terlebih dulu dengan menggunakan air steril.

     Sterilisasi dengan pemanasan dapat dilakukan pada bahan yang berdaging, caranya bahan bunga yang masih kuncup dicelupkan ke dalam spiritus dan kemudian di bakar. Cara ini diulang sampai tiga kali. Antera kemudian diambil dan ditanam diatas medium.

     Medium yang paling banyak digunakan adalah NG terutama untuk antera padi, tetapi dapat juga menggunakan medium MS atau VW untuk membudidayakan kepala sari anggrek Dendrobium. Yang perlu diperhatikan adalah zat-zat tambahan yang harus dibubuhkan pada medium baku untuk induksi kalus dan untuk deferensiasi berbeda. Zat-zat tambahan yang diperlukan untuk induksi kalus adalah 2,4 D atau dapat juga memakai NAA sebagai pengganti 2,4 D, atau MCPA (2-metyhl - 4-chlorophenoxy acetic acid) untuk pembentukan kalus padi. Kadar sukrosa juga perlu ditingkatkan berkisar 6% - 20%, juga ion NH4 yang berasal dari amonium-sulfat sebesar 3,5 m M/I serta KH2PO4 800m/liter medium sangat diperlukan khusus untuk antera padi. Sedangkan zat-zat tambahan untuk deferensiasi adalah kombinasi hormon dari golongan auksin dan sitokinin, sebaiknya 2,4 D sama sekali tidak dipakai, sedangkan kadar sukrosanya dikurangi sampai hanya 3% saja atau malahan dihilangkan sama sekali.

3. Faktor-faktor yang Menentukan Hasil Akhir Kultur Antera

1. Kondisi pertumbuhan tanaman donor, misalnya : temperatur, fotoperiodisasi dan intensitas cahaya
2. Umur tanaman donor, Disarankan bahwa tunas yang digunakan berasal dari awal pembungaan
3. Tingkat perkembangan pollen, tingkat optimum perkembangan pollen pada waktu diambil dari tunas untuk setiap jenis tanaman berbeda. Paling baik digunakan pollen pada tingkat pembelahan mitosis pertama dimana untuk menentukan stadium ini digunakan metode straining, yaitu acetocarmin 4% dalam 50% asam glasial asetad.
4. Metode sterilisasi, Tanaman satu dengan lainnya membutuhkan sterilan yang berbeda-beda. Misalnya sublimat, etanol, atau sodium hipoklorit
5. Pre-treatment, Beberapa jenis tanaman memerlukan perlakuan pendahuluan berupa temperatur rendah 8 derajat C selama empat hari (bunga padi), merendam dalam air yang ada butir-butir arangnya ataupun mengurangi tekanan atmosfir menjadi 12 mg/hg.
6. Metode diseksi
7. Kultur medium
8. Kondisi Ruang inkubasi, Suhu, cahaya, densitas antera dan orientasi eksplan perlu diperhatikan. Biasanya temperatur yang dibutuhkan adalah 25% - 28% C, tetapi ada yang memerlukan temperatur lebih tinggi, misalnya 35% C atau lebih.

     Permasalahan yang sering muncul pada kultur antera, antara lain adalah sebagai berikut:

1. Tanaman hasil budidaya masih banyak yang steril
2. Masih perlu dicari pencegahan yang efektif terhadap terjadinya tanaman bulai
3. Sampai sekarang masih belum berhasil membudidayakan kepala sari tanaman polongan

     Yang dimaksud dengan kultur embrio adalah memisahkan embrio yang belum dewasa dan menumbuhkannya secara kultur jaringan untuk mendapatkan tanaman yang viabel.

1. Tujuan Kultur Embrio

a. Memperpendek Siklus Breeding

     Tanaman yang semula membutuhkan waktu yang lama untuk berkecambah, dengan kultur ini akan menjadi lebih cepat berkecambah.

b. Menguji kecepatan viabilitasi biji

     Perkecambahan embrio dapat lebih nyata dan dapat lebih memberikan inteprestasi yang lebih jelas dari pada kalau menggunakan tes pewarnaan.

c. Memperbanyak tanaman langka

     Tanaman langka, seperti kelapa kopyor, sangat sulit untuk dibudidayakan secara normal. Sebab, kelapa kopyor mempunyai embrio yang lunak, sehingga dibawah kondisi normal tidak mungkin untuk berkecambah. Tetapi dengan teknik kultur embrio dapat diperoleh tanaman kelapa kopyor.

d. Memperoleh hibrid yang langka

     Program pemuliaan dengan mengadakan persilangan sering kali mengalami kegagalan. Ketidakberhasilan suatu persilangan disebabkan oleh praliferasi yang terhalang, atau fertilisasi dapat terjadi secara normal, tetapi embrio mati pada awal tingkat perkembangannya. Kematian ini mungkin disebabkan oleh sedikitnya endosperm atau endosperm tidak berkembang secara normal. Dalam hal demikian, embrio hibrid yang berkembang secara normal akhirnya mengalami keguguran karena tidak cukup tersedia makanan, atau mungkin endosperm mengalami kelainan. Untuk mengatasi hal tersebut perlu dilakukan penanaman embrio pada kultur medium.

2. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Keberhasilan Kultur Embrio

a. Genotif

     Pada beberapa jenis tumbuhan, embrio mudah tumbuh tetapi pada beberapa jenis tumbuhan lain sukar untuk tumbuh. Ha ini disebabkan oleh perbedaan kultivar dari jaringan yang sama.

b. Tingkat perkembangan embrio pada waktu dipisahkan

     Embrio yang sangat kecil lebih sulit dikulturkan daripada embrio yang telah lebih dulu berkembang.

c. Kondisi perkembangan tanaman induk

     Tanaman induk yang diambil dari rumah kaca biasanya pertumbuhannya lebih terkontrol, sehingga dapat menghasilkan endosperm yang perkembangannya baik.

d. Komposisi media makanan

     Media untuk pertumbuhan embrio harus mengandung unsur makro, unsur mikro dan gula. Faktor penting lainnya yang tidak boleh diabaikan adalah adanya ion ammonium dan potassium.

e. Oksigen

f. Cahaya

    Kadang-kadang untuk perkembangan embrio membutuhkan tempat gelap kira-kira selama 7 - 14 hari, baru setelah itu dipindahkan ketempat terang untuk pembentukan klorofil.

g. Temperatur

     Temperatur optimum yang dibutuhkan umumnya tergantung dari jenis tumbuhan yang digunakan. Secara normal temperatur paling tinggi adalah 22 derajat - 28 derajat.

C. Kultur Protoplas

1. Pengertian Protoplas

     Kultur jaringan semakin berkembang, dari membudidayakan suatu jaringan tanaman sampai membudidayakan protoplas dari sel tanaman, dan yang paling mutakhir adalah budidaya khloroplas dari suatu protoplas sel tanaman. Apabila dua protoplas dari sel tanaman yang berlainan jenis atau bahkan berbeda suku difusikan (digabungkan), maka akan terjadi fusi protoplas. Bila protoplas yang digunakan diambil dari jaringan tubuh atau soma, maka hasil yang terjadi disebut somatic cross. Budidaya protoplas sangat penting bagi para ilmuwan, baik dari bidang genetika, pemuliaan tanaman, biologi dan para ahli tumbuhan lainnya. Untuk dapat mempelajari lebih lanjut tentang budidaya protoplas, maka kita perlu membahas terlebih dahulu pengertian dan struktur sel tanaman.

     Protoplas adalah sel hidup yang telah dihilangkan dinding selnya, yang disebut sebagai sel telanjang. Dinding sel yang pertama (dinding primitif atau lamela tengah) adalah dinding yang terdiri dari zat pektin dan protopektin, pembentukan kedua zat ini melalui proses pembelahan sel. Selanjutnya dinding yang pertama ini mengalami penebalan sampai tiga kali, yaitu penebalan primer, penebalan sekunder, dan penebalan tertier. Penebalan primer terdiri dari zat sellulosa. Untuk keperluan kultur protoplas, maka dinding primitif dan penebalan primer yang mengandung zat-zat pektin, protopektin dan sellulosa perlu dihilangkan.

     Dinding sel merupakan bagian sel mati yang berfungsi melindungi seluruh bagian sel yang berada didalamnya terhadao faktor-faktor luar, baik faktor fisik maupun faktor kimiawi yang berpengaruh negatif. Selain itu, dinding sel juga mempunyai fungsi lain, yakni mengatur transpor arus zat-zat yang masuk dan yang keluar melalui dinding sel, meneruskan rangsangan dari sel yang satu ke sel yang lainnya, kadang-kadang juga membantu dalam fotosintesis, karena dengan adanya dinding sel, pada epidermis daun yang berbentuk seperti lensa, maka sinar matahari dibiaskan masuk kedalam mesofil. Akibatnya lebih banyak sinar matahari berpenetrasi masuk ke dalam mesofil sampai ke parenkhim palisade, sehingga fotosintesis dapat meningkat.

     Protoplas terdiri dari benda-benda hidup dan benda-benda mati. Pada garis besarnya protoplas dapat dibagi menjadi dua bagian, yaitu sitoplasma dan vakuola. Didalam sitoplasma inilah terdapat plasma dasar, organela dan sistem membran. Plasma dasar mempunyai substansi dasar yang teridiri dari zat protein, lemak, asam nuklein dan lain-lain substansi yang dapat larut didalam air. Yang paling penting dalam hubungannya dengan budidaya protoplas adalah organela, sebab didalam organela ini terdapat nukleus, plastida, mitokondria dan organela lainnya. Plastida itu sendiri sebenarnya merupakan nama kelompok butir-butir didalam plasma yang mempunyai ukuran lebih kecil dari pada nukleus, tetapi lebih besar dari ukuran mitokondria. Macam-macam plastida yang dikenal adalah khloroplas, Khromoplas dan leukoplas.

2. Isolasi Protoplas

   

     Isolasi protoplas adalah usaha untuk menghasilkan protoplas sebanyak-banyaknya dari suatu jaringan. Protoplas ini dapat diperoleh dengan jalan maserasi, yaitu pemisahan protoplas dari dinding selnya dengan cara melarutkan pektin dan derivatnya dengan zat-zat yang dapat mengoksidasi. Untuk melarutkan zat pektin dapat memakai pektinase, pektiolase, atau macerozym, sedangkan untuk melarutkan zat sellulosa dapat menggunakan sellulase.

     Menurut Soeryowinoto (1989), banyak permasalahan yang dihadapi dalam isolasi protoplas ini, antara lain adalah :

1. Enzim atau kombinasi enzim apa yang terbaik untuk dipakai?
2. Seberapa lama jaringan harus direndam dalam larutan enzim ?
3. Bagaimana cara mensterilisasi enzim ?
4. Pelarutan dinding sel yang terbaik dilakukan dalam gelap atau dibawah cahaya lampu ?
5. Bagaimana caranya agar protoplas yang diperoleh itu utuh, tidak pecah dan masih berfungsi ?
6. Zat apakah yang terbaik untuk digunakan agar tidak pecah (anti blasting) ?
7. Berapakah konsentrasi yang terbaik agar tidak pecah ?

D. Kultur Tanaman Berkayu

     Penelitian tentang pembiakan secara vegetatif dengan menggunakan tanaman hortikultura atau tanaman pertanian sudah lebih dahulu dilakukan dari pada tanaman berkayu. Teknik ataupun kendala yang dihadapi pada kultur tanaman hortikultura atau tanaman pertanian sudah lebih dikuasai. Sedangkan untuk mengembangkan tanaman berkayu masih banyak menemui kesulitan, antara lain :

• Eksplan yang diambil dari tanaman dewasa (tanaman berkayu) biasanya mempunyai kemampuan mengadakan regenerasi yang sangat lemah.
• Tanaman berkayu sering mengeluarkan ekskresi yang mungkin menyebabkan racun terhadap medium tanam, sehingga mengganggu pertumbuhan dan perkembangan kultur.
• Kecepatan untuk replikasi atau multiplikasi sangat rendah.
• Sterilisasi eksplan mengalami kesulitan, karena tanaman induk hidup dilapangan (luar).

• Perlakuan gelap (selama inkubasi tidak menggunakan cahaya) : ada yang membutuhkan 100% gelap, tetapi adapula yang pertumbuhannya semakin baik bila mendapatkan terang 30% dan gelap 60%. Semuanya itu tergantung dari eksplan yang digunakan.
• Menambahkan vitamin C didalam medium: Untuk setiap jenis tanaman dosis pemberian vitamin C berbeda-beda, tetapi dosis yang umum digunakan adlaah 50ml/100 cc sampai 100 mg/100ml, atau 500 mg per-liter.
• Dengan memberikan cystein didalam medium ; Dengan menambahkan arang aktif (active charcoal), yaitu arang batok. Penggunaannya adalah sebanyak satu sendok teh untuk satu liter medium. Charcoal dapat pula digunakan untuk pembersihan cairan, misalnya untuk menyimpan pepaya agar tetap hijau dan tidak busuk. Karena arang aktif ini harganya cukup mahal, maka sering dibuat sendiri. Cara pembuatannya adalah sebagai berikut : batok kelapa dibakar, kemudian arang yang jadi ditumbuk halus dan disaring dengan saringan mesh (halus).

E. Kultur Biji Steril

     Usaha mencari bahan eksplan untuk dibudidayakan secara kultur jaringan dapat dilakukan dengan berbagai macam cara. Eksplan dari tanaman berkayu biasanya diambil dari luar (lapangan), tetapi untuk eksplan tanaman hias akan lebih aman sterilisasinya apabila diambil dari rumah kaca. Misalnya, Anggrek, begonia, melati dan kenanga. Tanaman-tanaman semusim juga sering dipersiapkan untuk diambil sebagai eksplan dengan membudidayakannya dahulu didalam rumah kaca. Misalnya, tanaman tembakau, melon, kentang, wortel, comphrey, bawah putih dan sebagainya.

F. Propagasi atau Kloning

     Propagasi adalah pembiakan secara vegetatif untuk mendapatkan klon. Sedangkan klon itu sendiri adalah suatu populasi yang mempunyai sifat morfologis dan sifat genetik yang sama. Dengan usaha propagasi/kloning pada kultur jaringan dapat dihasilkan tanaman dengan jumlah besar dalam waktu yang relatif singkat. Secara singkat teknik pelaksanaan propagasi/kloning, antara lain :

• Memilih eksplan
• Memilih Medium
• Persiapan eksplan medium dan alat
• Sterilisasi alat dan medium
• Sterilisasi eksplan
• Menanam eksplan
• Pemeliharaan sampai tumbuh kalus dan planlet
• Aglimatisasi atau pemindahan ke lapangan (plot)

     Cara memilih eksplan harus didasari oleh ilmu pengetahuan tentang sel, yaitu bagian-bagian tanaman yang mempunyai sel aktif membelah. Pada bagian-bagian sel ini (yaitu sel meristem) mengandung hormon tanaman, sehingga hasilnya dapat seperti yang diharapkan. Pengambilan eksplan dari jaringan dewasa ( in deferensiasi), dalam waktu lama tidak akan terbentuk kalus, sebab kemampuan untuk membentuk jaringan tidak ada. Meskipun dari tanaman dewasa ini terjadi penambahan volume, tetapi tidak terjadi penambahan sel sebab tidak mengalami pembelahan sel. Sedangkan pada jaringan meristem akan terjadi pertumbuhan.

J. Penyerbukan dan Pembuahan Secara Kultur Jaringan

     Penyerbukan meliputi pengangkutan serbuk sari dari benang sari ke kepala putik dan jatuhnya butir-butir serbuk sari di atas kepala putik. Didalam bunga, letak kepala putik dibawah kepala sari, sehingga serbuk sari yang berat dapat jatuh diatas kepala putik dengan mudah. Kepala putik menempel pada kepala sari. Bilamana kepala sari pecah, maka akan segera terjadi kontak langsung dengan kepala putik dan terjadilah penyerbukan. Serbuk sari dapat tertiup oleh angin atau terbawa oleh serangga dan secara kebetulan jatuh diatas kepala putik. Cara penyerbukan demikian disebut penyerbukan spontan.

     Bilamana sebuk sari jatuh diatas kepala putik, maka dalam keadaan normal ia akan menyerap cairan yang dihasilkan oleh kepala putik, kemudian menggembung dan berkecambah. Sebelum berkecambah, tiap serbuk sari mengandung dua buah inti vegetatif dan inti generatif. Pada waktu mulai berkecambah, inti generatif (inti sperma) membelah diri, sehingga dalam tabung serbuk sari terdapat dua buah inti sperma dan sebuah inti vegetatif. Pertumbuhan tabung serbuk sari seluruhnya diatur oleh inti vegetatif. Sedangkan tugas dari kedua inti sperma adalah untuk melakukan pembuahan didalam bakal biji.

     Serbuk sari yang berkecambah diatas kepala putik akan tumbuh memanjang kebawah dan masuk kedalam saluran tangkai putik menuju ke ruang bakal buah sampai ujungnya dapat menyentuh kandung embrio. Dengan demikian, tabung serbuk sari harus lebih panjang daripada tangkai putik. Setelah dapat masuk kedalam ruang bakal buah, maka terjadilah proses pembuahan.

     Adapula bunga yang tidak dapat mengadakan penyerbukan, sebab tangkai putiknya terlalu panjang dan tangkai sarinya pendek. Dengan demikian, letak kepala putik lebih tinggi daripada kepala sari. Tipe bunga demikian biasanya tidak pernah terdapat bersama pada satu pohon, sehingga penyerbukan akan sulit terjadi.

     Faktor luar juga dapat menghalangi terjadinya penyerbukan, misalnya bila pada waktu bunga mekar tidak ada angin atau serangga yang dapat membantu penyerbukan. Hujan lebat juga dapat menyebabkan tidak terjadinya penyerbukan, sebab butir-butir serbuk sari berlekatan satu dengan yang lain (menggumpal) sehingga tidak dapat meninggalkan ruang sari.

     Kadang-kadang serbuk sari yang telah basah dapat segera berkecambah, dan membentuk tabung sari yang panjang. Bilamana cuacanya kemudian berubah menjadi cerah dan ada panas matahari, maka tabung serbuk sari tersebut dapat lekas mengering dan kehilangan daya tumbuhnya. Selain itu, bunga yang basah dapat menjadi sarang penyakit dan mudah menjadi busuk. Bilamana bunga telah layu dan kepala putiknya telah mengering, maka penyerbukan biasanya akan gagal. Gagalnya penyerbukan dapat pula disebabkan karena serbuk sari yang melakukan penyerbukan bermutu rendah atau kepala putiknya cacad dan tidak sehat.